1.4生物表面活性劑的提取、鑒定和臨界膠束濃度測(cè)定

取培養(yǎng)72 h的細(xì)菌發(fā)酵液在4℃、5000×g離心30 min，取上清液用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，然后加入等體積的三氯甲烷/甲醇（2∶1，V∶V）混勻，萃取三次合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥后，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到淺黃色漿狀物，即為生物表面活性劑粗產(chǎn)物。

薄層色譜：取0.2 g提取的上述粗產(chǎn)物溶于1 mL的氯仿中，點(diǎn)樣于硅膠G板進(jìn)行薄層色譜分析，三氯甲烷/甲醇/水（65∶15∶1，V∶V）為展開(kāi)劑，用不同的顯色劑顯色。（1）苯酚-硫酸試劑：3 g苯酚與5 mL硫酸溶解于95 mL乙醇中，如果顯棕色斑點(diǎn)，則有糖脂存在，反之糖脂不存在；（2）茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，如果斑點(diǎn)顯紅色，則有脂肽存在，反之脂肽不存在。

紅外掃描分析（Fouriertransforminfraredspectrometer，F(xiàn)T-IR）：將生物表面活性劑粗產(chǎn)品溶于三氯甲烷后，在制備型硅膠薄板上進(jìn)行分離，依照顯色帶位置刮下目的硅膠層，用三氯甲烷/甲烷（1∶1，V∶V）提取后于40℃下減壓蒸干，得到部分純化的生物表面活性劑。將上述生物表面活性劑溶于甲醇，采用KBr壓片法（1～2 mg樣品+200 mgKBr，干燥處理后研細(xì)），混合壓成透明薄片后紅外掃描分析測(cè)定。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度測(cè)定（Critical micelle concentration，CMC）：精確稱(chēng)取上述提取所得的產(chǎn)物粗品溶于蒸餾水中，配制成不同濃度梯度（0～500 mg·L-1）的產(chǎn)物溶液，測(cè)定溶液的表面張力，并依據(jù)表面活性劑濃度-表面張力曲線求得臨界膠束濃度值。

1.5細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1測(cè)定指標(biāo)

發(fā)酵液表面張力值以吊環(huán)法測(cè)定，乳化性能采用超聲體積比法測(cè)定。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集菌體，于105℃烘干至恒重后稱(chēng)重，以菌體干重表示生物量。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取2次后，45℃減壓蒸干，將殘余物溶于等體積的0.05 mol·L-1NaHCO3中，以硫酸苯酚法測(cè)定糖脂含量。

1.5.2碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入10 g·L-1的葡萄糖、甘油、花生油、可溶性淀粉、液體石蠟、麥芽糖、乳糖、蔗糖（對(duì)照組不加碳源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.3氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

以碳源實(shí)驗(yàn)中獲得的最優(yōu)碳源作為選定碳源，取10 g碳源加入1 L不含（NH4）2SO4無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述培養(yǎng)基，分別加入2 g·L-1的硝酸鈉、硫酸銨、脲、硝酸銨（對(duì)照組不加氮源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.4碳氮比對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL含不同碳氮源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。固定氮源為2 g·L-1，分別加入已優(yōu)化的碳源，控制比例為1、5、10、15、20、25、30、35、40（對(duì)照組不加氮源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.5溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。控制搖床溫度在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.6 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。控制培養(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.7NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。控制培養(yǎng)基NaCl濃度為0、5、10、15、20、25、30、50、80、120、160 g·L-1。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.8菌株147發(fā)酵動(dòng)態(tài)圖

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.6生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴增溶效果

25 mL三角瓶中加入過(guò)量的苯并［a］芘、芘、熒蒽和10 mL不同濃度的生物表面活性劑粗產(chǎn)物溶液，然后加入0.02%的疊氮化鈉抑制微生物的生長(zhǎng)。蓋好塞子并用封口膜封口后，25℃、50 r·min-1振蕩48 h后，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中5000 r·min-1離心15 min，取上清液加入等體積的二氯甲烷∶正己烷=1∶1（V∶V）萃取3次，收集洗脫液并于40℃濃縮至干，用甲醇定容到2 mL，過(guò)0.22μm孔徑濾膜后HPLC分析。